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T-4- 126 – Identification et classification taxonomique des micro-organismes présentés pour usage comme suppléments en vertu de la Loi sur les engrais

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À compter du 26 octobre 2020, le règlement modifié sur les engrais est en vigueur. Les parties réglementées peuvent se conformer soit au « nouveau » règlement ou soit à l'« ancien » règlement pour une période de 3 ans. Cela s'applique à la fabrication, à la vente, à l'importation ou à l'exportation d'engrais et de suppléments réglementés en vertu de la Loi sur les engrais.

Nouvelles exigences réglementaires (à partir du du 26 octobre 2020)

1. Objectif

L'objectif du présent document est de fournir des directives en ce qui a trait aux méthodologies et aux techniques scientifiques acceptable pour l'identification des micro-organismes utilisés comme ingrédients actifs dans les suppléments microbiens.

Le présent document porte principalement sur l'identification taxonomique des cultures pures de micro-organismes appartenant aux règnes des 1) bactéries, 2) archéobactéries et 3) champignons, qu'ils soient d'origine naturelle ou modifiés par manipulation génétique. Il comprend également des directives sur les méthodes d'identification relatives aux consortiums microbiens.

2. Identification microbienne

La connaissance des caractéristiques phénotypiques, génotypiques et biologiques d'un micro-organisme est essentielle pour le différencier des organismes pathogènes et toxigènes apparentés ou des autres organismes nuisibles pour la santé végétale, animale et humaine et pour l'environnement. Par conséquent, une identification précise du ou des micro-organismes actifs constitue une composante fondamentale de toutes les évaluations d'innocuité des suppléments microbiens réglementés en vertu de la Loi sur les engrais. D'ailleurs, les conclusions relatives à l'innocuité du produit ou à ses répercussions sur la santé humaine ou sur l'environnement sont valides seulement si le ou les micro-organismes actifs sont identifiés correctement.

Les directives générales à l'égard des propriétés dangereuses des micro-organismes reconnus pour être des pathogènes humains ou animaux se trouvent sur le site Web du Centre de la biosécurité de l'Agence de la santé publique du Canada et dans ePATHogène – la base de données sur les groupes de risque de l'Agence de la santé publique du Canada.

Approche polyphasique de l'identification microbienne

Le choix de la ou des méthodes utilisées pour l'identification microbienne dépend du type et de la nature du micro-organisme. La ou les méthodes choisies doivent être bien décrites dans la littérature scientifique et conformes à celles qui sont actuellement utilisées dans le domaine de l'identification et de la classification taxonomique microbienne. Ces méthodes doivent aussi permettre l'identification des organismes au niveau du genre, des espèces et, si possible, de la souche. La robustesse, la précision et la validité des méthodologies utilisées pour identifier le micro-organisme constituent des caractéristiques cruciales dans l'évaluation de l'innocuité du produit.

Le choix des méthodes d'identification microbienne est laissé à la discrétion du requérant. Toutefois, l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA) recommande que les demandeurs intègrent l'analyse microbiologique et phénotypique classique ainsi que des outils moléculaires pour s'assurer de l'exactitude de l'identification. Les forces et les faiblesses des diverses méthodes d'identification doivent être prises en considération, de sorte que les méthodes choisies se complètent les unes les autres, pour en arriver à une identification concluante et définitive du micro-organisme et pour permettre une différenciation claire de l'organisme par rapport aux autres espèces et souches pathogènes ou toxigènes étroitement apparentées. Les méthodes couramment utilisées pour identifier et justifier la classification taxonomique des micro-organismes sont résumées ci-dessous.

2.1 Analyse phénotypique

Les méthodes phénotypiques conviennent aux micro-organismes qui peuvent croître en culture pure sur un milieu artificiel, et dont les paramètres de croissance ainsi que les profils physiologiques et biochimiques sont bien établis.

L'expression des phénotypes microbiens est hautement dépendante des variables environnementales (p. ex. pH de la culture, température, milieu de culture sélectif ou non sélectif, épuisement des éléments nutritifs, présence de facteurs de stress, etc.) et, par conséquent, peut introduire des incohérences dans le processus d'identification. Les méthodes phénotypiques sont acceptables seulement si les critères de réponse suffisent à identifier le micro-organisme avec un haut niveau de confiance et à le distinguer des organismes phylogénétiquement et étroitement apparentés qui posent potentiellement des problèmes d'innocuité. En outre, l'applicabilité de la méthode repose sur la robustesse des renseignements retrouvés dans les bases de données de référence. Pour être acceptée, l'analyse phénotypique doit être appuyée par des données provenant d'autres méthodes dans le cadre de l'approche polyphasique.

2.1.1 Caractères morphologiques

La morphologie de la colonie et des cellules permet d'obtenir une identification initiale relativement à un micro-organisme. Cela s'effectue par des méthodes simples d'isolation et de culture du micro-organisme et par l'observation visuelle subséquente au moyen du microscope. Les propriétés morphologiques comprennent:

  1. la forme;
  2. la taille;
  3. les caractéristiques de la surface et la pigmentation;
  4. les caractéristiques de la paroi cellulaire (procédé de coloration de Gram);
  5. les caractéristiques de sporulation;
  6. les mécanismes de motilité;
  7. les autres inclusions cellulaires et caractéristiques ultrastructurales.

2.1.2 Caractéristiques biochimiques, physiologiques et métaboliques

L'évaluation phénotypique comprend l'étude du profil biochimique et des propriétés métaboliques d'un micro-organisme par l'entremise de tests sur ses conditions de croissance, sur ses activités enzymatiques et sur la composition de ses cellules en acide gras.

Les tests biochimiques utilisent des milieux de croissance, des éléments nutritifs, des produits chimiques ou des conditions de croissance particulières afin d'obtenir une réponse biochimique observable et mesurable du micro-organisme, permettant ainsi son identification et sa caractérisation. Ces tests comprennent: l'utilisation de sources de carbone et d'azote, différentes conditions de croissance (anaérobie ou aérobie; température optimale et gamme de température, pH optimal et gamme de pH), des conditions osmotiques préférentielles, la production de produits de fermentation, la production d'enzymes, la production de composés antimicrobiens, de même que la sensibilité aux inhibiteurs métaboliques et aux antibiotiques. Parmi les tests reconnus, on retrouve les tests au rouge de phénol et carbohydrate , les tests de catalase et d'oxydase, les tests d'oxydation/fermentation, les tests au rouge de méthyle, les tests de Voges-Proskauer, la réduction des nitrates, l'hydrolyse de l'amidon, l'hydrolyse du tryptophane, la production de sulfure d'hydrogène, l'utilisation du citrate, les réactions du petit-lait tournesolé, etc. Plusieurs systèmes commerciaux miniaturisés et automatisés sont actuellement offerts et sont assortis de procédures de contrôle de la qualité bien définies qui permettent l'identification rapide des micro-organismes.

2.1.3 Analyse de la composition en esters méthyliques d'acide gras (analyse EMAG)

On peut identifier les micro-organismes en analysant les profils d'acides gras de cellules entières ou de membranes cellulaires par la chromatographie en phase gazeuse ou la spectrométrie de masse. Les profils d'acides gras (type, contenu, proportion et variation) sont comparés à ceux des organismes connus pour identifier le genre et l'espèce.

2.2 Méthodes moléculaires

La biologie moléculaire apporte un ensemble de nouveaux outils puissants. Ces méthodes ont grandement amélioré la rapidité de détecter, d'identifier et de classifier rapidement les micro-organismes en plus d'établir la relation taxonomique parmi les genres et les espèces apparentés . L'identification, par les méthodes moléculaires, repose sur la comparaison de séquences d'acides nucléiques (ADN, ARN) ou de profils protéiques d'un micro-organisme avec les données documentées d'organismes connus. Les méthodes moléculaires sont considérées comme suffisamment sensibles pour permettre une détection à des concentrations faibles de micro-organismes viables ou non viables autant dans les échantillons de cultures pures et que ceux de cultures complexes (p. ex., terre, tourbe, eau, etc.).

2.2.1 Méthodes génotypiques basées sur des modèles et du séquençage

Dans les techniques faisant appel au modèle, une série de fragments provenant de l'ADN chromosomique d'un organisme sont générés. Les fragments générés sont alors séparés en fonction de leur taille pour créer un profil, ou une empreinte génétique unique à cet organisme et aux organismes très apparentés. Ces renseignements sont compilés pour créer une base de données d'empreintes génétiques des organismes connus, à laquelle le profil du micro-organisme testé peut être comparé. Selon la similarité entre les profils des deux organismes, ils seront considérés comme très apparentés ou pas du tout apparentés. Voici quelques exemples de techniques faisant appel au modèle:

Méthode Technologie
PCR à éléments répétitifs (réaction en chaîne de la polymérase) Les amorces ciblent des éléments répétitifs spécifiques distribués dans les chromosomes de façon aléatoire.
Polymorphisme de longueur des fragments amplifiés (AFLP) L'ADN chromosomique est digéré par des enzymes de restriction, suivi d'une PCR à l'aide d'adaptateurs couplés aux sites de restriction.
Profilage ribosomique L'ADN chromosomique est digéré par des enzymes de restriction, suivi d'une recherche pour les gènes ribosomiques.
Amplification aléatoire de l'ADN polymorphe De courts segments de l'ADN chromosomique sont amplifiés de façon aléatoire par un ensemble d'amorces courtes arbitraires.
Électrophorèse sur gel en champ pulsé Des enzymes rares de restriction de coupe sont utilisées pour couper l'ADN chromosomique en gros fragments, et les fragments sont déterminés.
PCR multiplex Des gènes de diagnostic sont ciblés par les amorces de la PCR.

Dans les techniques faisant appel au séquençage, la séquence d'un segment particulier d'ADN est déterminée. Le degré de similarité, ou la concordance, entre une séquence d'ADN provenant d'une base de données et une séquence testée indique dans quelle mesure les deux organismes sont apparentés. Des algorithmes informatisés sont ensuite utilisés pour comparer plusieurs séquences les unes aux autres et établir un arbre phylogénétique à partir des résultats. Voici quelques exemples de techniques faisant appel au séquençage :

Méthode Technologie
Séquençage du gène ribosomique en petites sous-unités (ARNr 16s) Les amorces conservées sont utilisées pour amplifier puis séquencer le gène ARNr en petites sous-unités. Les séquences sont ensuite comparées à une base de données.
Typage génomique multi-locus (MLST) et analyse génomique multi-locus (MLSA) Séquençage de l'ADN d'un sous-ensemble particulier de gènes conservés et semi-conservés pour une espèce donnée, suivi d'une comparaison des séquences concaténées.

Les techniques d'empreinte génétique et les méthodes faisant appel au séquençage ont toutes deux leurs forces et leurs faiblesses. Les méthodes faisant appel au séquençage, tel que l'analyse du gène d'ARNr 16s, se sont avérées efficaces quant à l'établissement des relations phylogénétiques globales parmi les bactéries au niveau du genre, de la famille, de l'ordre et du phylum, tandis que les méthodes ayant recours à l'empreinte génétique sont bonnes pour distinguer les relations au niveau de la souche ou de l'espèce, mais sont moins fiables pour établir l'interdépendance au-dessus du niveau de l'espèce ou du genre. Compte tenu de ces limites, il est important de valider les résultats des méthodes d'identification génotypique microbienne avec des données provenant d'autres sources (p. ex., des analyses morphologiques et/ou phénotypiques).

L'identification génotypique fiable requiert des bases de données contenant des renseignements de séquences complètes et exactes d'un grand nombre de taxons. Les bases de données de séquences génétiques qui sont utilisées couramment comprennent:

  1. GenBank®;
  2. Ribosomal Database Project (RDP) (en anglais seulement);
  3. Europe's collection of nucleotide sequence data (EMBL) (en anglais seulement);
  4. Universal Protein Resource (UniProt) (en anglais seulement).

Les requérants ne sont pas limités à l'utilisation des documents de références énumérés ci-dessus; ils sont mentionnés seulement à titre indicatif.

2.2.2 Méthodes basées sur les techniques protéomiques

Les méthodes qui déterminent l'activité d'enzymes particuliers, comme la catalase ou l'oxydase, ou les fonctions métaboliques, telles que la capacité de dégrader le lactose, ont longtemps été utilisées comme méthodes de base pour l'identification bactérienne. Les outils protéomiques offrent un excellent complément aux techniques classiques fondées sur la génomique ou la microbiologie en ce qui concerne la classification, l'identification, et la caractérisation phénotypique des bactéries. Les techniques protéomiques prédominantes qui ont été utilisées pour l'identification et la caractérisation bactérienne comprennent les suivantes :

  1. la désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice spectrométrie à temps de vol (technologie MALDI-TOF-MS);
  2. la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation (technologie ESI-MS);
  3. la désorption-ionisation laser assistée par surface (technologie SELDI);
  4. la spectrométrie de masse;
  5. l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl-sulfate de sodium (SDS-PAGE) à une ou deux dimensions;
  6. une combinaison de spectrométrie de masse, d'électrophorèse sur gel, et de bio-informatiques, etc.

Les méthodes sérologiques, comme le transfert de type Western, l'immunoprécipitation (IP) et la méthode immunoenzymatique ELISA (ELISA), utilisent des anticorps pour déceler des protéines précises qui sont uniques ou caractéristiques à un micro-organisme . L'applicabilité des méthodes sérologiques dépend de la disponibilité, de la sensibilité et de la spécificité des anticorps utilisés.

2.3 Séquençage du génome entier

Le séquençage de génome entier est une méthode exhaustive pour analyser des génomes entiers. La capacité de produire un grand nombre de données avec les séquenceurs d'aujourd'hui fait du séquençage de génome entier un puissant outil pour la recherche en génomique. Le séquençage de génome entier permet de voir le génome entier base par base en haute résolution, capture les petites et les grandes variantes et fournit de grandes quantités de données en peu de temps. Cette approche permet d'étudier tous les gènes à partir d'une seule culture d'organisme, offrant ainsi une analyse complète du génome microbien, y compris l'identification précise de la souche. Le séquençage de génome entier peut détecter des variantes nucléotidiques uniques, des insertions et des suppressions, des changements au nombre de copies et de grandes variantes structurelles.

Le séquençage de génome entier peut être considéré comme l'outil idéal dans la caractérisation de souche. En conséquence, les résultats du séquençage de génome entier seront acceptés à eux seuls pour corroborer l'identification microbienne dans le cadre d'une demande d'enregistrement en vertu de la Loi sur les engrais.

3. Méthodes d'identification des consortiums microbiens

Un consortium microbien est un groupe complexe de micro-organismes, dont la composition demeure inchangée sans autre manipulation, provenant d'un seul environnement naturel . L'ACIA recommande l'une des approches suivantes pour l'identification taxonomique des consortiums microbiens :

3.1 Identification de toutes les espèces au moyen d'une approche polyphasique

Il s'agit de l'approche qui devrait être choisie, dans la mesure du possible. Il est possible d'utiliser une combinaison de méthodes moléculaires, biochimiques et microbiologiques.

3.2 Identification des groupements taxonomiques et dépistage des composantes microbiennes dangereuses

Lorsqu'il est impossible de désigner avec précision le groupe taxonomique, il est possible de recourir à l'identification au niveau du genre (et peut-être de la famille) pour décrire les principaux constituants dans un consortium. Par exemple, le clonage et le séquençage du gène ARNr 16S peuvent servir à la détection des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) attribuées à des genres ou à des familles spécifiques de micro-organismes. La disponibilité limitée des isolats environnementaux dans les bases de données ou la faible concentration des constituants au sein du consortium peut être un facteur limitant l'identification des constituants. Cette approche ou une autre approche similaire peut servir de moyen pour identifier les principaux genres et les principales familles des micro-organismes d'un consortium.

Lorsque les groupements taxonomiques sont identifiés, le consortium doit être soumis à un examen de dépistage à l'égard des espèces dangereuses pertinentes au produit en question. Les indicateurs liés au type de produit et à la source doivent être choisis par le requérant. Par exemple, un produit pourrait être contrôlé relativement aux espèces pathogènes pour les humains tels que Salmonella Sp., Listeria Monocytogenes, Vibro Sp., Campylobacter Sp., Clostridia Sp., Bacillus Anthracis, Pseudomonas Aeruginosa, Yersinia Sp., Candida Albicans, Aspergillus Fumigatus, coliformes fécaux, Enterococci, rotavirus, norovirus et Ascaris Lumbricoides. Veuillez noter que la Section de l'innocuité des engrais peut exiger le dépistage d'indicateurs supplémentaires au moment de l'examen. Les tests pathogéniques doivent être effectués sur la formulation du produit final. Des contrôles utilisant des filtres chimiques et des contrôles positifs et négatifs doivent être fournis avec les données d'essai sur la formulation.

4. Considérations supplémentaires relatives à l'identification taxonomique de champignons

La classification et l'identification de champignons s'appuyaient sur les critères morphologiques jusqu'à ce que les progrès en techniques moléculaires aient permis leur application. Les techniques moléculaires sont devenues un outil important pour établir le statut taxonomique de différents champignons. La section 2 (ci-dessus) décrit de manière générale l'approche polyphasique recommandée aux fins d'identification taxonomique, laquelle s'applique aussi aux champignons.

Le dimorphisme sexuel chez les champignons ajoute à la complexité de l'identification taxonomique. De nombreux champignons présentent une forme téléomorphe (sexuelle) et une forme anamorphe (asexuelle). Ces deux formes ont souvent été dotées de noms différents et peuvent même être de familles ou de genres différents. Par ailleurs, de nombreuses paires anamorphe-téléomorphe demeurent non identifiées et sont découvertes au fur et à mesure que les données du séquençage se font disponibles. Parmi les méthodes électrophorétiques, mentionnons le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Les méthodes de typage fondées sur le RFLP sont utilisées pour révéler les connexions anamorphe-téléomorphe. Plus couramment, on utilise le RFLP d'ADNr amplifié au moyen de la réaction en chaîne de la polymérase.

Lorsqu'une base de données publique est utilisée pour identifier les champignons au moyen des séquences de nucléotides, les relations connues seront déterminées; toutefois il faut garder à l'esprit que les renseignements taxonomiques peuvent différer selon les bases de données.

5. Aide pour l'identification taxonomique

Nous recommandons que les requérants demandent l'aide d'un service d'identification taxonomique ou d'un professionnel du domaine. Un certain nombre de collections importantes de cultures ou de répertoires ainsi que des laboratoires commerciaux offrent des services tarifiés aux fins d'identification et de caractérisation.

6. Classification et nomenclature taxonomiques

L'identification taxonomique du ou des micro-organismes doit être fondée sur le système de classification taxonomique actuellement utilisé et reconnu mondialement. La description du ou des micro-organismes qui entrent dans la composition du produit et ses caractéristiques doivent correspondre aux caractéristiques décrites dans les ressources et les références standards qui sont couramment utilisées par la communauté scientifique pour valider la classification taxonomique. Le nom taxonomique doit suivre le code de nomenclature officiellement reconnu par l'International Committee on Systematics of Prokaryotes (ICSP). Les demandeurs doivent vérifier la Liste approuvée des noms de bactéries afin de veiller à ce que la nomenclature soit conforme à la Liste de validation la plus récente élaborée et mise à jour par l'International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM).

Veuillez prendre note que la classification et la nomenclature taxonomique microbienne, particulièrement les bactéries, sont en état de changement constant étant donné que les méthodes évoluent pour engendrer une information de plus en plus fiable afin d'identifier et de classifier – ou de classifier à nouveau – le système taxonomique actuel. La vérification de concordance avec plus d'une ressource ou référence aidera à valider la désignation et la classification taxonomiques actuelles d'un micro-organisme.

Coordonnées

Section de l'innocuité des engrais
a/s Bureau de présentation de demandes préalables à la mise en marché (BPDPM)
Agence canadienne d'inspection des aliments
59 promenade Camelot
Ottawa ON K1A 0Y9
Canada
Par téléphone : 1-855-212-7695
Télécopieur : 613-773-7115
Courriel : cfia.paso-bpdpm.acia@inspection.gc.ca

Ancienne exigences réglementaires (en vigueur jusqu'au 26 octobre 2023)

Mai 2017

1. Introduction

1.1 But

Le but du présent document est de fournir des directives aux demandeurs et aux requérants en ce qui a trait aux méthodologies et aux techniques scientifiques acceptables aux fins d'identification des micro-organismes utilisés comme ingrédients actifs dans les suppléments microbiensNote de bas de page 1.

Le présent document se concentre sur l'identification taxonomique des cultures pures de micro-organismes appartenant aux règnes des :

  1. bactéries;
  2. archéobactéries;
  3. champignons.

Il comprend également des directives sur les méthodes d'identification relatives aux consortiums microbiens qui contient de multiples genres de micro-organismes qui fonctionnent comme une communauté. Le document dresse la liste des ressources standards et des documents de référence sur la classification taxonomique et la nomenclature des groupes de micro-organismes mentionnés plus haut.

1.2 Identification microbienne

La connaissance des caractéristiques phénotypiques, génotypiques et biologiques d'un micro-organisme est essentielle pour en arriver à le différencier des organismes pathogènes ou toxigènes apparentés ou des autres micro-organismes nuisibles à la santé végétale, animale, humaine et à l'environnement. C'est pourquoi une identification précise de micro-organismes actifs est un élément primordial pour toutes les évaluations d'innocuité des suppléments microbiens réglementés en vertu de la Loi sur les engrais. D'ailleurs, les conclusions relatives à l'innocuité du produit ou à ses répercussions sur la santé humaine ou sur l'environnement sont valides seulement si le ou micro-organismes actifs sont identifiés correctement.

Les directives générales à l'égard des propriétés dangereuses des micro-organismes reconnus pour être des pathogènes humains se trouvent sur le site Web du Centre de la biosécurité de l'Agence de la santé publique du CanadaNote de bas de page 2.

2. Approche polyphasique de l'identification microbienne

Le choix de la ou des méthodes utilisées pour l'identification microbienne dépend du type et de la nature du micro-organisme. La ou les méthodes choisies doivent être bien décrites dans la littérature scientifique et conformes à celles qui sont actuellement utilisées dans le domaine de l'identification et de la classification taxonomique microbienne. Ces méthodes doivent aussi permettre l'identification des organismes aux niveaux du genre, des espèces et, si possible, de la souche. La robustesse, la précision et la validité des méthodologies utilisées pour identifier le micro-organisme sont des éléments importants dans l'évaluation de l'innocuité du produit.

Le choix des méthodes d'identification microbienne est à la discrétion du requérant. Toutefois, la Section de l'innocuité des engrais recommande que les demandeurs adoptent une approche polyphasique intégrée qui comprend l'analyse microbiologique et phénotypique classique ainsi que des outils moléculaires, afin d'identifier avec précision le ou les micro-organismes actifs. On doit tenir compte des forces et des faiblesses des différentes méthodes d'identification, de sorte que les méthodes choisies se complètent les unes les autres pour en arriver à une identification concluante et définitive du micro-organisme et pour permettre une différenciation claire de l'organisme à par rapport aux autres espèces et souches pathogènes et/ou toxigènes étroitement apparentées. Les méthodes couramment utilisées pour identifier et justifier la classification taxonomique des micro-organismes sont résumées ci-dessous.

2.1 Analyse phénotypique

L'analyse préliminaire dans l'identification microbienne se fait souvent avec une ou plusieurs méthodes phénotypiques. Les méthodes phénotypiques conviennent aux micro-organismes qui sont cultivables (c.-à-d. qui peuvent croître en culture pure sur un milieu artificiel), et dont les paramètres de croissance, ainsi que les profils physiologique et biochimique sont bien établis.

L'expression des phénotypes microbiens est hautement dépendante des variables environnementales (p. ex., le pH de la culture, la température, le milieu de culture sélectif ou non sélectif, l'appauvrissement des nutriments, la présence de facteurs de stress, etc.), et par conséquent, peut introduire des incohérences dans le processus d'identification. Les méthodes phénotypiques sont acceptables seulement si les critères relatifs à la réponse sont suffisants pour identifier avec certitude le micro-organisme et le distinguer de souches phylogénétiquement et étroitement apparentées qui peuvent donner lieu à des problèmes d'innocuité. Par ailleurs, l'applicabilité de la méthode repose sur la robustesse des renseignements retrouvés dans les bases de données de référence. En conséquence, les résultats obtenus des méthodes phénotypiques requièrent l'appui de données provenant d'autres méthodes afin d'identifier avec précision un micro-organisme.

2.1.a Analyse des caractères morphologiques

La morphologie de la colonie et des cellules permet d'obtenir une identification initiale relativement à un micro-organisme. Cela s'effectue par des méthodes simples d'isolation et de culture du micro-organisme et par l'observation visuelle subséquente au moyen du microscope. Les propriétés morphologiques comprennent :

  1. la forme;
  2. la taille;
  3. les caractéristiques de la surface et la pigmentation;
  4. les caractéristiques de la paroi cellulaire (procédé de coloration de Gram);
  5. les caractéristiques de sporulation;
  6. les mécanismes de motilité;
  7. les autres inclusions cellulaires et caractéristiques ultrastructurales.

2.1.b Analyse des caractéristiques biochimiques, physiologiques et métaboliques

L'évaluation phénotypique comprend l'étude du profil biochimique et des propriétés métaboliques d'un micro-organisme par l'entremise de test sur ses conditions de croissance, sur ses activités enzymatiques et sur la composition de ses cellules en acide gras.

Les tests biochimiques utilisent des milieux de croissance, des nutriments, des produits chimiques ou des conditions de croissance particuliers afin d'obtenir une réponse biochimique observable et mesurable du micro-organisme, permettant ainsi son identification et sa caractérisation. Ces tests comprennent : l'utilisation de sources de carbone et d'azote, différentes conditions de croissance (anaérobie ou aérobie; température optimale et intervalle de température, pH optimal et intervalle de pH), des conditions osmotiques préférentielles, la production de produits de fermentation, la production d'enzymes, la production de composés antimicrobiens, de même que la sensibilité aux inhibiteurs métaboliques et antibiotiques. Parmi les tests reconnus, on retrouve : les tests au rouge de phénol et carbohydrate, les tests de catalase et d'oxydase, les tests oxydation-fermentation, les tests au rouge de méthyle, les tests de Voges-Proskauer, la réduction des nitrates, l'hydrolyse de l'amidon, l'hydrolyse du tryptophane, la production de sulfure d'hydrogène, l'utilisation du citrate, les réactions du petit-lait tournesolé, etc. Plusieurs systèmes commerciaux miniaturisés et automatisés sont actuellement offerts et sont assortis de procédures de contrôle de la qualité bien définies qui permettent l'identification rapide des micro-organismes.

2.1.c Analyse de la composition en esters méthyliques d'acide gras (analyse EMAG)

On peut identifier les micro-organismes en analysant les profils d'acides gras des cellules entières ou des membranes cellulaires par la chromatographie gaz-liquide ou la spectrométrie de masse. Les données sur le type, le contenu, la proportion et la variation du profil des acides gras sont utilisées pour identifier et caractériser le genre et l'espèce en les comparant aux profils d'acides gras d'organismes connus.

2.2 Méthodes moléculaires

La biologie moléculaire apporte un ensemble de nouveaux outils puissants : des méthodes moléculaires qui ont aidé à détecter les plus petites variations parmi les espèces microbiennes et les souches. Ces méthodes ont grandement amélioré la capacité de détecter, d'identifier et de classifier rapidement les micro-organismes en plus d'établir la relation taxonomique parmi les genres et les espèces apparentés. L'identification, par les méthodes moléculaires, s'appuie sur la comparaison de séquences d'acides nucléiques (ADN, ARN) ou de profils protéiques d'un micro-organisme avec les données documentées d'organismes connus. Les méthodes moléculaires sont considérées comme des méthodes suffisamment sensibles pour permettre une détection à des concentrations faibles de micro-organismes viables ou non viables autant pour les échantillons de culture pure que ceux de culture complexe (p. ex., terre, tourbe, eau, etc.).

2.2.a Méthodes génotypiques

L'identification microbienne par des méthodes génotypiques est une alternative ou un complément aux méthodes phénotypiques établies. De façon générale, les méthodes génotypiques pour l'identification microbienne peuvent se diviser en deux catégories comme suit :

  1. techniques faisant appel au modèle ou à l'empreinte génétique;
  2. techniques faisant appel au séquençage.

Dans les techniques faisant appel au modèle, une série de fragments provenant de l'ADN chromosomique d'un organisme sont générés au moyen d'une méthode systémique. Les fragments générés sont alors séparés en fonction de leurs tailles pour créer un profil, ou une empreinte génétique unique à cet organisme et aux organismes très apparentés. On peut créer un répertoire ou une base de données avec un nombre suffisant de renseignements. Le profil des tests du micro-organisme peut alors être comparé au répertoire ou aux bases de données. Selon la similarité entre les profils de deux organismes, ils seront considérés comme très apparentés ou pas du tout. Voici des exemples de quelques techniques faisant appel au modèle ou à l'empreinte génétique :

  1. hybridation des acides nucléiques (analyse de transfert de Southern ou hybridation en phase solution);
  2. polymorphisme de longueur des fragments amplifiés, ou AFLP;
  3. électrophorèse sur gel en champ pulsé;
  4. amplification aléatoire de l'ADN polymorphe;
  5. réaction en chaîne de la polymérase (PCR) multiplex

Dans les techniques faisant appel au séquençage, la séquence d'un segment particulier d'ADN est déterminée. Comme pour le génotypage, une base de données de séquences précises d'ADN est générée, ce qui permet alors de comparer la séquence test obtenue aux séquences de la base de données. Le degré de similarité, ou la concordance, entre les deux séquences indique dans quelle mesure ces deux organismes sont apparentés. Jusqu'à présent, un certain nombre d'algorithmes au moyen d'ordinateur ont été créés afin de pouvoir comparer les nombreuses séquences les unes aux autres et d'en établir un arbre phylogénétique à partir des résultats. Voici quelques exemples de techniques faisant appel au séquençage :

  1. l'analyse séquentielle du gène d'ARNr 16s;
  2. le typage génomique multi-locus ou MLST;
  3. l'analyse génomique multi-locus ou MLSA.

Les techniques d'empreinte génétique et les méthodes faisant appel au séquençage ont toutes deux leurs forces et leurs faiblesses. Traditionnellement, les méthodes faisant appel au séquençage, tel que l'analyse du gène d'ARNr 16s, se sont avérées efficaces quant à l'établissement des relations phylogénétiques globales parmi les bactéries au niveau du genre, de la famille, de l'ordre et du phylum, tandis que les méthodes ayant recours à l'empreinte génétique sont bonnes pour distinguer les relations au niveau de la souche ou de l'espèce, mais sont moins fiables pour établir l'interdépendance au-dessus du niveau de l'espèce ou du genre. D'autres limites liées aux méthodes génotypiques comprennent :

  1. les difficultés relatives à la différenciation entre les espèces qui partagent des séquences de régions conservées identiques ou similaires;
  2. les renseignements limités sur la qualité des données séquentielles disponibles dans les bases de données publiques;
  3. la complexité de l'ensemble de la nomenclature taxonomique.

Compte tenu de tout ce qui précède, il est important de valider les résultats des méthodes génotypiques pour l'identification microbienne avec des données provenant d'autres sources (p. ex., les analyses morphologique et phénotypique).

Une identification génotypique fiable requiert des bases de données contenant des renseignements de séquences complètes et exactes d'un grand nombre de taxons. Les bases de données de séquences génétiques qui sont utilisées couramment comprennent :

  1. GenBank®Note de bas de page 3;
  2. projet sur la base de données ribosomique ou RDPNote de bas de page 4,
  3. la collection de données sur les séquences de nucléotides de l'Europe ou EMBLNote de bas de page 5;
  4. la ressource universelle sur les protéines (UniProt)Note de bas de page 6.

Les requérants ne sont pas limités à l'utilisation des documents de références énumérés ci-dessus; ils sont mentionnés seulement à titre indicatif.

2.2.b Méthodes basées sur les protéines

Bien que les renseignements génotypiques soient utiles pour identifier un organisme et en déterminer les liens de parenté avec les autres organismes, les méthodes basées sur les propriétés phénotypiques demeurent essentielles à la compréhension des activités fonctionnelles et physiologiques d'un organisme au niveau des protéines. Les méthodes phénotypiques qui déterminent l'activité d'enzymes particuliers, comme la catalase ou l'oxydase, ou les fonctions métaboliques, tel que la capacité de dégrader le lactose, ont longtemps été utilisées comme une méthode de base pour l'identification bactérienne. L'arrivée de nouveaux outils protéomiques qui sont fondés principalement sur la spectrométrie de masse et permettent de tirer rapidement des renseignements de biomolécules produites par un organisme offre un excellent complément aux techniques classiques fondées sur la génomique ou la microbiologie en ce qui concerne la classification, l'identification, et la caractérisation phénotypique des bactéries. Les techniques protéomiques prédominantes qui ont été utilisées à l'égard de l'identification et de la caractérisation bactérienne comprennent :

  1. désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice spectrométrie à temps de vol (technologie MALDI-TOF-MS)
  2. spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation (technologie ESI-MS)
  3. désorption-ionisation laser assistée par surface (technologie SELDI);
  4. spectrométrie de masse;
  5. électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl-sulfate de sodium (SDS-PAGE) à une ou deux dimensions;
  6. combinaison de spectrométrie de masse, d'électrophorèse sur gel, et de bio-informatiques, etc.

De plus, les méthodes sérologiques comme le transfert de type Western, l'immunoprécipitation (IP) et l'épreuve immuno-enzymatique compétitive (ELISA) utilisent des anticorps pour déceler des protéines précises, lesquelles sont uniques ou caractéristiques à un micro-organisme. L'applicabilité des méthodes sérologiques dépend de la disponibilité, de la sensibilité et de la spécificité des anticorps utilisés. Il existe des trousses commerciales pour l'immunodétection de plusieurs micro-organismes.

2.3 Génomique

Plus récemment, le profilage complet du transcriptome, du génome, du protéome ou du métabolome a servi à identifier et caractériser les organismes. Plusieurs technologies modernes comme les analyses de biopuces d'ADN ou de protéines, le profilage protéique par spectrométrie de masse, la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et les plates-formes métabolomiques microbiennes in silico sont de plus en plus utilisées pour l'identification et la caractérisation des micro-organismes.

La connaissance quant à la sensibilité et à la spécificité des outils génomiques et de leurs applications dans l'identification microbiennes évoluent rapidement. Toutefois, les difficultés liées à la normalisation des méthodologies génomiques (y compris l'optimisation des protocoles et des outils bio-informatiques pour l'annotation, l'interprétation de données fiables, etc.) continuent d'entraver leur applicabilité à l'évaluation de l'innocuité (risque) et à la prise de décisions en matière de réglementation. La Section de l'innocuité des engrais tiendra compte des données générées par des méthodes génomiques au cas par cas.

3. Méthodes d'identification des consortiums microbiens

En ce qui concerne le consortium microbien, la Section de l'innocuité des engrais recommande que les demandeurs adoptent une des trois approches suivantes :

3.1 L'identification de toutes les espèces au moyen d'une approche polyphasique.

Lorsque cela est possible, cette approche doit être choisie. On peut utiliser une combinaison de méthodes moléculaires, biochimiques et microbiologiques.

3.1.a Méthodes moléculaires

  1. Les méthodes fondées sur la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) : PCR, l'ADN ribosomique et autres gènes différenciés par une méthode taxonomique, l'ADN ribosomique amplifié, les analyses de restriction, l'électrophorèse sur gel dénaturante, l'électrophorèse sur gel par gradient de température, le polymorphisme de taille des fragments de restrictions terminal, l'analyse de l'espace intergénique ribosomal, le polymorphisme de conformation simple brin, hétérogénéité de la chaîne de polymérase en chaîne, le séquençage des isolats cultivés, l'ADN polymorphe aléatoirement amplifié et la PCR fonctionnelle.
  2. Le clonage et le séquençage directs
  3. L'hybridation de sonde : de microréseaux à ADN

3.1.b Méthodes biochimiques

La composition de l'ADN et les épreuves cinétiques, les épreuves métaboliques et les analyses lipidiques. Veuillez consulter les sections 2.1b et 2.1c ci-dessus.

3.1.c Méthodes microbiologiques

Les techniques de comptage cellulaire, de cytométrie de flux et de tri cellulaire, de croissance sélective et d'examen microscopique.

3.2 Identifier les groupements taxonomiques

Là où il est impossible de désigner avec précision le groupe taxonomique en raison de la taille du consortium ou de la faible disponibilité de la culture, il est possible de recourir à l'identification au niveau du genre (et possiblement de la famille) pour décrire les principaux constituants dans un consortium. Par exemple, le clonage et le séquençage de ARNr 16S peuvent servir à la détection des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) attribuées à des genres ou à des familles spécifiques de micro-organismes. La disponibilité limitée des isolats environnementaux dans les bases de données ou la faible concentration des constituants au sein du consortium peut être un facteur limitant l'identification des constituants. Cette approche ou autre approche similaire peut servir de moyen d'identification des principaux genres et familles des micro-organismes d'un consortium.

3.3 Dépistage des composantes microbiennes dangereuses

Là où il n'est pas possible d'établir la taxonomie de tous les micro-organismes, les données concernant la présence de micro-organismes indicateurs peuvent être présentées. Le consortium doit subir un examen de dépistage à l'égard des espèces dangereuses pertinentes au produit en question en précisant clairement la désignation du niveau et du groupe taxonomique pour chacune des espèces. Les indicateurs liés au type de produit ou dépendant de la source doivent être choisis par le requérant. Par exemple, un produit pourrait être contrôlé relativement aux espèces pathogènes pour les humains tels que Salmonella Sp., Listeria Monocytogenes, Vibro Sp., Campylobacter Sp., Clostridia Sp., Bacillus Anthracis, Pseudomonas Aeruginosa, Yersinia Sp., Candida Albicans, Aspergillus Fumigatus, coliformes fécaux, Enterococci, rotavirus, norovirus and Ascaris Lumbricoides. Veuillez remarquer que la Section de l'innocuité des engrais peut exiger le dépistage d'indicateurs supplémentaires au moment de l'examen. Les tests pathogéniques doivent se faire sur la formulation du produit final. Les contrôles utilisant tous filtres chimiques ainsi que les contrôles positifs et négatifs doivent être présentés avec les données des tests sur la formulation.

4. Considérations supplémentaires relatives à l'identification taxonomique de champignons

La classification et l'identification de champignons s'appuyaient sur les critères morphologiques jusqu'à ce que les progrès en techniques moléculaires permettent leur application. Les techniques moléculaires sont devenues un outil important pour établir le statut taxonomique de différents champignons. La section 2 (ci-dessus) décrit de manière générale l'approche polyphasique recommandée aux fins d'identification taxonomique, laquelle s'applique aussi aux champignons.

Le dimorphisme sexuel chez les champignons ajoute à la complexité de l'identification taxonomique. De nombreux champignons présentent une forme téléomorphe (sexuelle) et une forme anamorphe (asexuelle). Ces deux formes ont souvent été nommées avec des noms différents et peuvent même se retrouver dans des genres ou des familles différents. Par ailleurs, de nombreuses paires anamorphe-téléomorphe demeurent non identifiées et sont découvertes au fur et à mesure de la disponibilité des données du séquençage. Parmi les méthodes électrophorétiques, le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Les méthodes de typage fondées sur le RFLP sont utilisées pour révéler les connexions anamorphe-téléomorphe. Plus couramment, on utilise le RFLP d'ADNr amplifié au moyen de la réaction en chaîne de la polymérase.

Lorsqu'une base de données publique est utilisée pour identifier les champignons au moyen des séquences de nucléotides, les relations connues seront déterminées, toutefois il faut garder à l'esprit que les renseignements taxonomiques peuvent différer selon les bases de données.

5. Aide pour l'identification taxonomique

Nous recommandons que les requérants sollicitent l'assistance d'un service ou d'un professionnel quant à l'identification taxonomique. Un certain nombre de collections importantes de cultures ou répertoires ainsi que des laboratoires commerciaux offrent des services tarifiés aux fins d'identification et de caractérisation.

6. Classification et nomenclature taxonomiques

L'identification taxonomique des micro-organismes doit être fondée sur le système de classification taxonomique actuellement utilisé et reconnu mondialement. La description du ou des micro-organismes qui entrent dans la composition d'un produit et ses caractéristiques doivent correspondre aux caractéristiques décrites dans les ressources standards ou les références qui sont couramment utilisées par la communauté scientifique afin de valider la classification taxonomique. Ces dernières comprennent, sans toutefois s'y limiter :

  1. des manuels tel que le Bergey's Manual of Systematic BacteriologyNote de bas de page 7;
  2. The ProkaryotesNote de bas de page 8;
  3. Applied Microbial SystematicsNote de bas de page 9;
  4. Principles of fungal taxonomyNote de bas de page 10;
  5. des ressources en ligne comme le Catalogue of LifeNote de bas de page 11;
  6. PubMed TaxonomyNote de bas de page 12 et UniProt TaxonomyNote de bas de page 13;
  7. des revues scientifiques avec comité de lecture.

Le nom taxonomique doit suivre le code de nomenclature officiellement reconnu par l'International Committee on Systematics of Prokaryotes (ICSP). Les demandeurs doivent vérifier la « Liste approuvée des noms de bactéries » afin de s'assurer que la nomenclature est en accord avec la dernière Liste de validation élaborée et mise à jour par l'International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)Note de bas de page 14.

Veuillez noter que la classification et la nomenclature taxonomique microbienne, particulièrement pour les bactéries, sont constamment en changement avec l'évolution des méthodologies afin de générer davantage de renseignements fiables afin d'identifier et de classer ou de reclasser le système taxonomique actuel. La vérification de concordance avec plus d'une ressource ou référence aidera à valider la désignation et la classification taxonomiques actuelles d'un micro-organisme.

Notes de bas de page

Note de bas de page 1

En vertu de la Loi sur les engrais, un « supplément » est défini comme étant toute substance ou tout mélange de substances, autres qu'un engrais, fabriqué, vendu ou représenté pour enrichir les sols ou favoriser la croissance des plantes ou à la productivité des récoltes.

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Note de bas de page 2

Agence de la santé publique Canada : Centre de la biosûreté.

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Note de bas de page 3

GenBank® du National Centre for Biotechnology Information (NCBI) – (en anglais seulement)

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Note de bas de page 4

Projet de base de données ribosomique (RDP) – (en anglais seulement)

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Note de bas de page 5

La base de données sur les nucléotides de l'EMBL (Laboratoire européen de biologie moléculaire) – (en anglais seulement)

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Note de bas de page 6

Universal Protein Resource Knowledgebase (UniProtKB) – (en anglais seulement)

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Note de bas de page 7

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology – (en anglais seulement), deuxième édition, volume 1 à 5, de la compagnie Williams et Wilkins, Baltimore, 2001-2009

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Note de bas de page 8

The Prokaryotes – (en anglais seulement). Troisième édition, 2007, 7000 pages, collection-7, publication Springer

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Note de bas de page 9

Applied microbial systematics. Priest, F. G.; Goodfellow, M. (Édition) 2000, 500 pages, couverture souple. ISBN : 978-0-7923-6518-1.

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Note de bas de page 10

Principles of fungal taxonomy. P. H. B. Talbot. 1971, p. 3-274. ISBN 10 : 0333115619.

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Note de bas de page 11

Liste de vérification annuelle du Catalogue of life – (en anglais seulement) 2010

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Note de bas de page 12

PubMed Taxonomy – (en anglais seulement)

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Note de bas de page 13

UniProt Taxonomy Database – (en anglais seulement)

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Note de bas de page 14

Approved List of Bacterial Names – (en anglais seulement). Microbiology validation list. Skerman VBD, McGowan V, Sneath PHA. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 30: 225-420, doi : 10.1099/00207713-30-1-225

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