Document des décisions DD96-08 :
Détermination de la sécurité environnementale du canola (Brassica napus L.) à forte teneur en acide laurique créé par Calgene Inc.

Révisé

Distribué : 1996-02

Le présent document de décisions vise à expliquer la décision réglementaire prise conformément à la directive Directive 94-08 (Dir 94-08) Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux, au cahier parallèle BIO1994-09 - La biologie du Brassica napus L. (canola/colza), et à la directive Dir95-03, Directive relative à l'évaluation des végétaux dotés de caractères nouveaux utilisés comme aliments du bétail.

Le Bureau de biotechnologie végétale et la Section des aliments du bétail, avec la participation de l'Unité d'évaluation des risques phytosanitaires, a évalué les données présentées par Calgene Inc. relativement à deux lignées de canola transformées qui, dans le présent document, sont désignées sous le nom de « canola à forte teneur en acide laurique ». On a introduit dans ces végétaux un gène conférant aux graines une teneur plus élevée en acide laurique ainsi qu'un gène conférant à la plante une résistance à la kanamycine, comme marqueur pour la sélection. ACIA a déterminé que ces végétaux à caractères nouveaux ne devraient pas présenter de risque pour l'environnement.

La dissémination en milieu ouvert et l'utilisation du tourtreau pour l'alimentation du bétail des lignées 23-198 et 23-18-17 de canola à forte teneur en acide laurique ainsi d'autres lignées de B. napus qui en seraient issues sont par conséquent considérées comme étant sécuritaires pourvu qu'aucun autre caractère nouveau ne leur soit incorporé.

* Dans le document révisé, le terme colza à forte teneur en acide laurique a été changé pour le terme canola à forte teneur en acide laurique.

Table des matières

1. Brève identification des végétaux à caractères nouveaux (VCN)
2. Données de base
3. Description des traits nouveaux
   1. Graines produisant une huile riche en acide laurique
   2. Résistance à la kanamycine
   3. Méthode de développement
   4. Stabilité de l'intégration au génome des plantes
4. Critères d'évaluation de la sécurité environnementale
   1. Possibilité que les VCN se comportent comme des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent des habitats naturels
   2. Possibilité de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement
   3. Possibilité que les végétaux deviennent nuisibles
   4. Impact possible sur les organismes non visés
   5. Impact possible sur la biodiversité
5. Critères d'évaluation nutritionnelle en vue de l'utilisation comme aliment du bétail
   1. Facteurs antinutritionnels
   2. Composition nutritive des VCN
6. Décision réglementaire

I. Brève identification des végétaux à caractères nouveaux (VCN)

Désignation des VCN : Lignées 23-198 et 23-18-17 de canola à forte teneur en acide laurique

Demandeur : Calgene Inc.

Espèce : Brassica napus L.

Caractères nouveaux : Production de graines à teneur élevée en acide laurique et en acide myristique;
résistance à la kanamycine (antibiotique).

Mèthode d'introduction des caractères : Transformation au moyen de l'Agrobacterium tumefaciens

Utilisation proposée des VCN : Grande culture visant la production séparée d'une huile destinée à l'alimentation humaine et à des usages industriels, ainsi que du tourteau pour l'alimentation animale. Les VCN ne seront pas cultivés à l'extérieur de la zone de culture habituelle du canola. La production sera donnée à contrat.

II. Données de base

Calgene Inc. a créé deux lignées de canola dont les graines ont une teneur élevée en acide laurique. Les lignées 23-198 et 23-18-17, désignées sous le nom de « canola à forte teneur en acide laurique » dans le présent document, pourraient remplacer les sources actuelles d'huiles lauriques exotiques (huile de palmiste, etc.) utilisées pour l'alimentation humaine et animale et à des fins industrielles, comme la fabrication de détergents à lessive.

La création de ces lignées basée sur la technique de l'ADN recombinant, résulte de l'introduction d'un gène végétal et d'un gène bactérien dans le cultivar de B. napus 212/86. Le gène végétal code pour une des enzymes de la voie de biosynthèse des acides gras dans la graine en développement; l'activité de cette enzyme libère de l'acide laurique, un acide gras saturé. L'autre gène, celui de la résistance à la kanamycine, ne présente aucun intérêt agronomique; pendant la mise au point des nouvelles lignées, il a servi à distinguer les sujets modifiés des sujets non modifiés.

Les nouvelles lignées font l'objet d'essais en milieu confiné au Canada depuis 1993 : Alberta (1993-1995); Saskatchewan (1993-1995); Manitoba (1993-1995); Ontario (1994). Les États-Unis en ont approuvé la commercialisation.

Calgene Inc. a fourni une description détaillée du vecteur de transformation et du processus de modification ainsi que des données et de l'information sur l'identité du canola à forte teneur en acide laurique, sur le nombre de sites d'insertion des gènes, sur l'intégrité des gènes insérés, sur le nombre de copies, sur le degré d'expression des gènes et sur le rôle des gènes insérés et des séquences régulatrices chez les organismes donneurs. Calgene a aussi fourni les résultats d'analyses de ségrégation et communiqué les séquences nucléotidiques complètes.

Le demandeur a identifié et caractérisé les protéines nouvelles, décrit les produits de dégradation, précisé l'incidence qu'ils pourraient avoir sur les voies métaboliques et effectué une étude de la toxicité possible de ces produits pour les organismes ayant des interactions avec le canola. Il a aussi fourni un grand nombre de publications scientifiques.

Le demandeur a comparé certaines caractéristiques agronomiques des nouvelles lignées, comme la capacité de survie hivernale, la germination des graines, la vigueur des semis, l'établissement des peuplements, la vigueur des plants, la fertilité, la période de floraison, la précocité de maturation des graines, le rendement grainier, l'égrenage sur pied, la verse et la tenue à la récolte, aux caractéristiques correspondantes de contreparties de B. napus non modifiées. Il a également évalué l'adaptation au stress, y compris la sensibilité à divers pathogènes et insectes.

Calgene a enfin effectué une analyse des graines, notamment quant aux protéines, au profil des acides gras présents dans l'huile et aux toxines endogènes.

Afin de d'évaluer le risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux conformément à la directive de réglementation Dir 94-08, le Bureau de biotechnologie végétale, (avec la participation de l'Unité d'évaluation des risques phytosanitaires) a passé en revue les renseignements ci-devant en fonction des critères d'évaluation suivants :

• possibilité que les VCN se comportent comme des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent des habitats naturels;
• flux génétique possible vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement;
• possibilité que les VCN deviennent nuisibles;
• impact possible des VCN ou de leurs produits géniques sur les espèces non visées, y compris l'être humain;
• impact possible sur la biodiversité.

La Section des aliments du bétail  a aussi examiné les renseignements ci-devant en fonction des critères d'évaluation servant à déterminer l'innocuité et l'efficacité des aliments du bétail qui apparaissent dans la directive Dir95-03:

• impact possible sur le bétail
• impact possible sur la nutrition du bétail.

III. Description des traits nouveaux

1. Graines produisant une huile riche en acide laurique

• Un gène provenant du laurier de Californie (Umbellularia californica) a été introduit dans le cultivar de B. napus 212/86. Ce gène code pour une thioestérase (Bay TE), une des enzymes de la voie de biosynthèse des acides gras dans les graines en développement.
• Le gène est lié à un promoteur particulier aux graines qui n'est actif que dans l'embryon des graines en développement. Il ne s'exprime donc qu'à ce stade. Les graines sèches et les autres parties de la plante ne contiennent aucune concentration de cette enzyme qui puisse être détectée par voie immunologique.
• L'expression du gène entraîne la production d'une préprotéine de 382 acides aminés qui est transportée jusqu'au stroma de plastes, où un peptide de transport de 60 acides aminés est enlevé pour la production d'une enzyme Bay TE mûre. Cette enzyme représente 0,015 % des protéines extractibles totales de la graine, lorsque celle-ci est à mi-maturité.
• Des études ont démontré que l'enzyme Bay TE introduite n'est pas thermostable et se décompose entièrement en acides aminés et peptides inactifs après la digestion protéasique. Deux sites potentiels de glycosylation ont été repérés; cependant, selon les connaissances actuelles, il n'y a aucune glycosylation des protéines des plastes. Les thioestérases sont omniprésente chez les végétaux et les animaux, et l'enzyme Bay TE ne devrait pas être toxique ou allergène pour les organismes non visés. De plus, en utilisant une base de données sur les séquences génétiques, le demandeur a effectué une analyse comparative visant à déterminer si l'enzyme présentait une homologie avec les allergènes et les toxines dont la séquence est connue; aucune homologie significative n'a été constatée. Cependant, on a noté une homologie marquée entre l'enzyme et certaines thioestérases provenant d'espèces végétales comestibles.
• La séquence nucléotidique complète du gène a été fournie.
• L'enzyme Bay TE provoque une accumulation d'acide laurique (acide gras saturé 12:0) et, à un degré moindre, d'acide myristique (acide gras saturé 14:0) dans les molécules de triacylglycérol présentes dans l'huile de la graine, au détriment de l'acide oléique et de l'acide linoléique.

2. Résistance à la kanamycine

• La kanamycine est un antibiotique de type aminoside qui se lie aux ribosomes bactériens, causant ainsi une perturbation de la synthèse normale des protéines et la mort de la cellule bactérienne.
• Le gène de la résistance à la kanamycine, isolé à partir de la bactérie E. coli, code pour une enzyme qui empêche l'antibiotique de se lier aux ribosomes, par phosphorylation, rendant par le fait même la cellule résistante. Rien n'indique qu'il y ait incidence sur les voies métaboliques de la plante.
• Le gène est lié à un promoteur constitutif fort. La graine ne renferme aucune concentration de l'enzyme qui puisse être détectée par voie immunologique.
• La protéine est omniprésente dans l'environnement. Elle se dégrade rapidement en présence de substances simulant les sucs gastriques et intestinaux des mammifères.
• La séquence nucléotidique ne présente aucune homologie significative avec celles des toxines et allergènes énumérés dans la base de données GENEBANK DNA. On ne prévoit pas de propriété toxique puisque : (1) l'enzyme ne catalyse qu'une réaction spécifique qui utilise des antibiotiques de type aminoside comme substrat, (2) aucune toxicité n'a été rapportée dans les publications scientifiques malgré un usage répété, et (3) l'enzyme ne représente que 0,0008 % des protéines totales des graines et des feuilles, et n'est pas détectée dans le tourteau.
• La séquence nucléotidique complète du gène a été fournie.
• La présence du gène de résistance à la kanamycine dans l'alimentation du bétail ne devrait pas affecter l'efficacité de traitements aux antibiotiques. En effet, l'activity de la néomycine est demeurée stable pour une période de 56 jours après avoir été mélangée à du tourteau du canola à forte teneur en acide laurique, et n'était pas différente de l'activité observée pour la lignée non-modifiée.

3. Méthode de développement

• Le cultivar de B. napus 212/86 a été transformé à l'aide d'un vecteur binaire non pathogène désarmé. Ce vecteur contenait la séquence ADN-T d'un plasmide d'Agrobacterium tumefaciens dont les gènes responsables de la virulence et de la pathogénicité avaient été enlevés et remplacés par des gènes codant pour la production d'acide laurique et pour la résistance à la kanamycine. On sait que la séquence ADN-T du plasmide s'insère au hasard dans le génome de la plante. Toutefois, cette insertion est généralement stable, comme le montre le cas du canola à forte teneur en acide laurique.

4. Stabilité de l'intégration au génome des plantes

• Selon les données fournies, aucune séquence codante provenant de l'extérieur de la séquence ADN-T ne s'est insérée. On estime que la transformation initiale (événement 23) a entraîné l'insertion de 15 copies du gène, en cinq locus indépendants, comme le montrent les analyses de ségrégation et de Southern.
• Plusieurs générations séparent les lignées 23-198 et 23-18-17 du transformant initial. L'étude de transmission mendélienne des caractères, l'analyse de Southern et la PCR effectuées sur des sujets de troisième génération confirment la stabilité des gènes introduits, les bandes n'ayant pas changé de position. Comme certaines copies sont éliminées par ségrégation, comme prévu, il se peut que la population ne soit pas homogène par rapport au nombre de copies présentes.

IV. Critères d'évaluation de la sécurité environnementale

1. Possibilité que les VCN se comportent comme des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent des habitats naturels

ACIA a évalué les données soumises par Calgene Inc. sur les caractéristiques biologiques des lignées 23-18-17 et 23-198 en matière de reproduction et de survie. À partir de ces données, ACIA a déterminé que la germination des graines, le rendement grainier, la croissance des semis, la floraison et les dates de maturité étaient essentiellement équivalentes aux caractéristiques observées chez les variétés non modifiées. Les plants de canola à forte teneur en acide laurique sont en général plus grands, plus tardifs et moins productifs que ceux des variétés adaptées aux conditions canadiennes, ces caractéristiques étant héritées du cultivar souche (212/86). Par ailleurs, des études d'enfouissement ont montré que les graines de canola à forte teneur en acide laurique ne persistent pas dans les sols de l'Ouest canadien. On a en outre constaté, en laboratoire, que le potentiel de dormance n'était pas modifié. L'incidence des maladies (pourriture de la tige, jambe noire, tache noire, nervation noire, blanc, tige grise, fonte des semis, mosaïque du navet, mosaïque du chou-fleur et galle du collet) et la sensibilité aux insectes (altises et pucerons) ont été surveillées au cours d'essais au champ et en serre, et aucune différence n'a été relevée par rapport aux contreparties non modifiées.

Les lignées de canola à forte teneur en acide laurique n'ont reçu aucun gène spécifique supplémentaire codant pour la tolérance au froid ou l'hibernation. D'ailleurs, selon Calgene Inc., aucun plant qui aurait survécu à l'hiver n'a été observé au cours des années qui ont suivi les essais au champ menés au Canada.

Selon la directive BIO1994-09, sur la biologie du Brassica napus, les sujets non modifiés de cette espèce n'envahissent pas les habitats sauvages au Canada. Selon les renseignements fournis par Calgene Inc., les lignées de canola à forte teneur en acide laurique ne sont pas différentes des autres lignées à cet égard.

Aucun avantage compétitif n'a été conféré aux lignées 23-18-17 et 23-198. La modification de la composition des graines en acides gras ne rendra pas ces lignées nuisibles ou envahissantes pour les habitats naturels, puisque leurs caractéristiques de multiplication végétative sont restées les mêmes. Qui plus est, les plants spontanés de canola à forte teneur en acide laurique peuvent être maîtrisés avec les pratiques culturales courantes.

Compte tenu de ce qui précède et du fait que les caractères nouveaux n'ont pas pour objet de rendre les végétaux nuisibles ou envahissants, ACIA conclut que les lignées 23-18-17 et 23-198 ne risquent pas plus de devenir envahissantes que les variétés actuelles de B. napus.

2. Possibilité de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement

Chez le Brassica napus, le taux d'hybridation avec des sujets de la même espèce peut atteindre 30 %, et la plante peut aussi se croiser avec d'autres espèces (B. rapa, B. juncea, B. carinata, B. nigra, Diplotaxis muralis, Raphanus raphanistrum et Erucastrum gallicum) vivant dans les milieux perturbés (voir la directive BIO1994-09). Des études révèlent qu'une introgression a le plus de chances de se produire avec le B. rapa, l'autre espèce principale de canola, qui est parfois une mauvaise herbe des terres cultivées, tout particulièrement dans l'est des Prairies canadiennes.

Si des sujets riches en acide laurique apparaissaient à la suite d'un croisement interspécifique ou intergénérique, les caractères transmis ne conféreraient aucun avantage compétitif aux hybrides, qui pourraient être maîtrisés par les pratiques culturales courantes.

D'après ces considérations, ACIA conclut qu'un flux génétique depuis les lignées 23-18-17 et 23-198 vers les espèces apparentées est possible, mais que les sujets issus d'un tel croisement ne présenteraient pas un risque accru de se comporter en mauvaises herbes ou de devenir envahissants.

3. Possibilité que les végétaux deviennent nuisibles

L'effet recherché au moyen des deux caractères nouveaux n'a aucun lien avec le fait que ces végétaux puissent devenir des mauvaises herbes, sans compter que le B. napus n'est pas une espèce nuisible au Canada. En outre, les caractéristiques agronomiques, l'adaptation au stress et la composition quantitative et qualitative des végétaux (à l'exception des graines) se sont révélées semblables à celles des variétés actuelles de B. napus. Aucun appauvrissement inhabituel du sol n'est prévu, puisque le rendement des lignées modifiées est inférieur à celui de la lignée parentale non modifiée.

En conséquence, ACIA conclut que la modification n'a pas accru par inadvertance le risque que ces lignées deviennent des plantes nuisibles.

4. Impact possible sur les organismes non visés

La caractérisation détaillée des gènes nouveaux, des enzymes correspondantes et des nouveaux profils d'acides gras des graines, présentée brièvement à la partie III du présent document, nous amène à conclure que ni la toxicité ni les propriétés allergènes n'ont été modifiées et qu'il ne devrait y avoir aucun impact sur les organismes non visés. Les enzymes en question sont omniprésentes chez les végétaux et les animaux et sont rapidement inactivées par les substances simulant les sucs gastriques des mammifères, par dégradation enzymatique et protéolyse acide. L'enzyme Bay TE n'est produite que dans les graines en développement. La composition globale de la plante est inchangée. L'acide laurique est présent en fortes concentrations dans certaines sources alimentaires courantes, comme la noix de coco, l'huile de palme et le lait des mammifères. D'ailleurs, cet acide entre dans la composition de produits alimentaires.

La teneur des graines en acide érucique, en glucosinolates, des toxines endogènes, demeure en-deçà des limites définissant la qualité du canola. En outre, la teneur des graines en protéines et la qualité de ces protéines sont inchangées. Le gène inséré ne visait qu'à modifier le profil des acides gras contenus dans l'huile des graines. La teneur de celles-ci en lipides totaux est restée la même, mais il y a eu un accroissement de leur teneur en acide laurique (jusqu'à 40 %) et en acide myristique, une baisse de leur teneur en acides oléique, linoléique, palmitique, stéarique, arachidique et gadoléique et une légère hausse de leur teneur en acide béhénique. Les huiles extraites des lignées nouvelles ne respectent pas les exigences fixées pour l'huile de canola dans le Codex des produits chimiques alimentaires (1992) et les graines de canola à forte teneur en acide laurique ne doivent pas être mêlées aux graines de canola ordinaire destinées à la production d'huile de canola. Les lignées de canola à forte teneur en acide laurique seront cultivées sous contrat, afin de garantir une production séparée et d'éviter une contamination du canola conventionnel.

Compte tenu de ce qui précède, ACIA estime que les lignées de canola à forte teneur en acide laurique, si elles sont disséminées en milieu ouvert, ne présenteront pas d'interactions modifiées avec d'autres organismes, y compris les humains, que les autres variétés actuellement offertes sur le marché.

5. Impact possible sur la biodiversité

Les lignées 23-18-17 et 23-198 ne présentent aucun caractère phénotypique nouveau qui puisse en accroître l'utilisation à l'extérieur de la zone où le B. napus est cultivé au Canada. Les données fournies par Calgene Inc. ont convaincu ACIA que ces lignées ne risquent pas d'envahir les habitats naturels ou de devenir plus compétitives que leurs contreparties, tant dans des écosystèmes naturels que dans les milieux aménagés. Comme les espèces pouvant s'hybrider avec le canola ne poussent que dans des habitats perturbés, le transfert de gènes nouveaux n'aura aucune incidence sur les milieux sauvages.

ACIA conclut donc que l'incidence possible des lignées lauriques sur la biodiversité se compare à celle des variétés actuelles de B. napus.

V. Critères d'évaluation nutritionnelle en vue de l'utilisation comme aliment du bétail

1. Facteurs antinutritionnels

La quantité de glucosinolates dans le tourteau n'est pas différente de celle observée dans les dix lignées non modifiées. La quantité d'acide érucique dans l'huile des variétés testées était inférieure à 0,1 %. Les lignées de canola à forte teneur en acide laurique renferment une concentration de facteurs antinutritionnels inférieure à la norme établie pour le tourteau et l'huile, à savoir moins de 30 micromoles de glucosinolates par gramme de tourteau déshydraté et moins de 2 % d'acide érucique dans l'huile.

2. Composition nutritive des VCN

On n'a relevé aucun écart statistique dans la protéine brute, fibre brute, énergie brute, et acides aminés, entre le tourteau de canola à forte teneur en acide laurique et de la lignée parentale (212/86). Tel que prévu, le profil en acides gras des nouvelles lignées était différent de celui de toutes les variétés témoins. Le laurate constitue 40 % des acides gras de l'huile des nouvelles lignées, et le myristate en constitue 4 %. Si l'on se base sur la présence d'un niveau maximal de 4 % d'huile dans le tourteau, cela correspond à des niveaux de 1,6 % de laurate et de 0,16 % de myristate dans le tourteau. Puisque le taux d'utilisation du tourteau de canola varie de 5 à 25 % dans l'alimentation du bétail, le niveau maximum de laurate serait de 0,4 % et celui de myristate serait de 0,94 %. Ces concentrations n'auraient aucun impact significatif sur la valeur nutritive et la qualité des carcasses. L'effet de l'huile dans l'alimentation du bétail n'a pas été évalué dans le cadre de cette étude, puisque la commercialisation de cette huile spécialisée à haute teneur en acide laurique n'est pas prévue pour l'alimentation du bétail.

On estime que le tourteau des lignées 23-18-17 et 23-198 est équivalent au tourteau des lignées traditionnelles de canola en ce qui concerne la composition nutritive et la sécurité.

VI. Décision réglementaire

Après examen des données et des renseignements fournis par Calgene Inc. au Bureau de biotechnologie végétale,  conclut que les gènes nouveaux des lignées 23-18-17 et 23-198 ainsi que les caractères nouveaux y étant associés ne conféreraient, en cas de flux génétique, aucun avantage écologique intentionnel au canola ou aux plantes apparentées. Les caractéristiques de ces lignées, quant aux critères d'évaluation des risques pour l'environnement, restent les mêmes. Les comparaisons approfondies entre les lignées de canola à forte teneur en acide laurique et de B. napus non modifié n'ont révélé aucun effet imprévu.

Après examen des données et des renseignements fournis à la Section des aliments du bétail,  conclut que les gènes nouveaux des lignées 23-18-17 et 23-198 ainsi que les caractères nouveaux y étant associés ne soulèvent aucune inquiétude quant à la sécurité du bétail ou la composition nutritionnelle de ces lignées. L'huile et le tourteau de canola sont actuellement décrits à l'annexe IV du Règlement sur les aliments du bétail et peuvent donc servir à l'alimentation du bétail au Canada. Les lignées 23-18-17 et 23-198 ont été évaluées et le tourteau a été déclaré essentiellement équivalent au tourteau de variétés traditionnelles de canola. Il respecte donc la définition actuelle et peut être utilisé comme ingrédient des aliments du bétail au Canada. Pour le moment, l'huile extraite de ces lignées ne doit pas être utilisée pour l'alimentation du bétail

Si Calgene Inc. prend connaissance d'un risque pour l'environnement ou pour la santé des humains ou des animaux, lequel risque découlerait de la dissémination de ces cultivars au Canada ou ailleurs, Calgene Inc. transmettra immédiatement cette information à ACIA.  A la lumière de ces faits nouveaux, ACIA réévaluera l'incidence possible de ces végétaux et réévaluera sa décision.

La dissémination en milieu ouvert et l'utilisation du tourtreau pour l'alimentation du bétail des lignées 23-198 et 23-18-17, de canola à forte teneur en acide laurique ainsi d'autres lignées de B. napus qui en seraient issues sont par conséquent considérés comme état sécuritaires pourvu qu'aucun autre caractère nouveau ne leur soit incorporé.